在兔巩膜中基于二次谐评估用于近视的治疗性组织交联

• 目的：
  • Second harmonic generation signals (SHG) are emitted preferentially from collagenous tissue structures and have been used to evaluate photochemically-induced (CXL) crosslinking changes in the cornea.
  • Since therapeutic tissue crosslinking (TXL) using sodium hydroxymethylglycinate (SMG) of the sclera is a potential treatment for high myopia, we explored the use of SHG microscopy to evaluate the effects.
• 方法：
  • 在尸体兔头右眼的赤道12点位置（n=16）使用SMG（40-400mM）进行单次Tenon（ST）注射（400μL）
  • 3.5h后，使用860nm双光子激发400-450nm发射进行共聚焦显微镜（CM）扫描。
    • 图像的收集、处理和分析在哥伦比亚大学赫伯特·欧文综合癌症中心（Herbert Irving Comprehensive Cancer Center at Columbia University）的共聚焦和专用显微镜共享资源平台上进行。
    • 作为一种方法学上的对照，测量含有SMG和5-磷酸核黄素的溶液的SHG信号伪影以及浸泡然后从核黄素溶液中洗净巩膜组织（浸泡转移后洗涤2、3、5分钟）
    • 将组织按照外巩膜朝下的方向放置在圆形盖玻片上（厚度# 1.5，直径25mm；Warner Instruments, Hamden, CT, USA），安装在封闭的金属腔室中（AttoFluor细胞腔，Molecular Probes，Eugene，OR，美国）
    • 对于成像，我们在配备有Nikon 25x/ NA1.1 Apo LWD水浸物镜的Eclipse Ti显微镜支架（Nikon Instruments， Melville，NY，美国）上使用了Nikon A1R-MP激光扫描系统
    • 用Chanmeon Vision II可调激光器（Coherent，USA）的860nm激光器激发SHG信号，并在700nm激发样品进行自发荧光成像。
    • 使用400-450nm带通滤光片，使用费反扫描检测器检测背向散射SHG发射以及自发荧光。
    • 860nm处的激光功率为60mW（占总功率的2.5%），而80MHz处的激光脉冲宽度为140fs
    • 像素停留时间为6.2、3、10-9s/像素
    • 图像分辨率为1024像素/线
    • 使用NIS Elements软件（Version 4.3，Nikon）自动完成图像捕获
    • 通过使用显微镜扫描组织（预览）并捕获组织在整个图像视野中的可视化且不重叠的组织来选择捕获图像的区域
    • 对于浓度依赖性的比较研究，将每个图像上的深度调整为距图像约10-15 lm
    • 巩膜上层盖玻片还被用于"三明治"方法，以最大程度地减少组织不规则性，例如"褶皱或皱纹"，如果存在不同深度，则可以在图像上形成明显较暗的区域。
  • 对图形进行像素密度和纤维束"波纹度"分析。
    • 图片分析使用Fiji软件
    • 通过绘制直方图并取其平均值，从每个图像中获得像素密度，作为信号亮度的反应。
    • 然后检查了处理样品和对照样品之间的平均像素密度值的差异
    • 另外，使用从心血管文献采用的方法对波纹度进行了分析，该方法使用Fiji软件的Neuron J插件
    • 端到端的纤维长度基于鼠标控制的绘图工具获取，其中包含单个焦平面的图像
    • 然后测量距被追踪纤维的每一端的直线距离，并将其表示为线性距离
    • 再此基础上定义波纹度%：波纹度%=（波纹度[SMG]-1）/（波纹度[Control]-1），其中，波纹度[] = 长度[曲线]/长度[线性]
    • 在分析的重复上，每个独立样品，每个交联至少拍摄10张图像进行分析。
    • 每张图像内进行10次纤维测量，并针对没中交联条件评估10个图像
    • 对于每个图像，首先将10个光纤测量值平均。
    • 然后将10张图像的值取平均值，进行统计分析。
    • SHG测试的样图
      
  • 使用热变性（Tm）温度确认交联作用。
• 结果：
  • 治疗性组织交联定位研究表明，交联变化发生在注射部位和相邻部位。
  • 二次谐波产生信号揭示了大的纤维状胶原 束状结构，显示出不同程度的起伏。
  • 直方图显示400nM SMG中的信号增加超过40mM的6倍。
  • 这相当于400nM的δTM=13摄氏度，而40mM的δTm=4摄氏度
  • 波纹密度分析表明，由于SMG CXL，纤维直度增加
• 结论：
  • 通过SMG巩膜组织交联改变了二次谐波产生信号强度和纤维束波纹度。
  • 这些变化提供了对由治疗性交联技术引起的大分子变化的见解，并且可以提供一种评估由巩膜交联疗法引起的结缔组织蛋白变化的方法
• 文献来源：
  • doi:https://doi.org/10.1167/iovs.16-20241